바이오산업동향

“생명 과학자 기초 체력 다지기” 두 번째 주제는 우리에게 너무나 친숙한, 하지만 10년차 내공으로도 단번에 성공하기 쉽지 않은 “PCR”에 대해 알아 보고자 한다. PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응), 지금은 생명과학 연구자라면 누구나 경험이 있을 정도로 흔한 기술이 되었지만, 특정 유전자의 클론을 제작하고 재조합 단백질을 생산하기 위해 필수적인 기술로, 오늘날 생명공학의 비약적인 발전을 견인한 핵심 기술이다.  
 


Figure 1 DNA 복제 (Replication)와 중합효소 연쇄반응 (PCR) 비교
 

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR은 DNA 복제 (Replication) 반응을 고온에 안정한 Taq polymerase와 반응 온도를 프로그램으로 자동으로 조절할 수 있는 PCR 기계를 사용하여 연쇄적으로 일어나도록 만든 기술이다. PCR에 대해 알아보기에 앞서 PCR 반응의 기본이 되는 DNA 복제에 대해 알아 보자.

DNA 복제는 세포가 분열하기 전에 자신과 동일한 유전자를 전달해 주기 위해 DNA 사본을 만드는 과정이며, Topoisomerase, Helicase, DNA primase, DNA polymerase, DNA ligase로 구성된 5종의 효소 반응을 통해 일어난다. DNA 이중 나선은 5’->3’ 방향의 DNA 단일 가닥에 이와 상보적인 3’<-5’방향의 DNA 단일 가닥이 서로 염기쌍 (A=T, G≡C)의 수소결합으로 연결되어 있다.

DNA 복제는 주형 DNA의 이중 나선 구조를 푸는 과정으로 시작한다. Topoisomerase가 DNA에 결합하여 이중 나선이 꼬이는 것을 방지하는 동안 Helicase가 DNA 이중 나선을 풀면, 풀려진 단일 가닥에 single strand binding protein이 결합하여 상보적인 두 가닥이 다시 결합하는 것을 방지한다.

“Leading strand”라 불리는 3’<-5’ 주형 가닥에 DNA primase (RNA polymerase)가 결합하여 RNA primer를 합성하면, DNA polymerase는 RNA primer의 3’ OH에 주형 서열과 상보적인 nucleotide를 5’->3’ 방향으로 순차적으로 결합시켜 정방향 (->)으로 DNA 가닥을 연속적으로 합성한다. 여기서 한가지 궁금증이 생긴다. DNA primase가 왜 DNA polymerase가 아니고 RNA polymerase일까? 그 이유는 DNA polymerase는 중합 반응을 시작하는데 반드시 primer가 필요한 반면, RNA polymerase는 primer를 필요로 하지 않기 때문이다.

DNA 중합 반응에서 기억해야 할 것은 DNA polymerase는 항상 5’->3’ 방향으로만 합성한다는 점이다. 여기서 5’, 3’는 nucleotide를 구성하는 5탄당의 탄소 번호를 나타낸다. 앞서 합성된 3’OH에 새로운 deoxyNucleotide triphosphate의 di-phosphate가 떨어져 나가면서 서로 연결되어 phosphodiester 결합 [-3’-O-P-O-5’->]을 형성하면서 상보적인 사슬이 합성된다.


Figure 2 DNA 중합 반응의 방향성 (5'->3')

 

“Lagging strand”라 불리는 5’->3’ 주형 가닥은 5’ 말단부터 합성을 시작하면 상보적으로 합성되는 DNA는 3’->5’ 방향이 되어야 하는데, 앞서 언급했듯이 DNA polymerase는 5’->3’ 방향으로만 합성이 가능하므로 5’ 말단에서 시작하는 것이 불가능하다. 이러한 문제를 해결하기 위해 lagging strand는 주형 DNA의 말단으로부터 약 150-200 bp 떨어진 서열에서 시작하여 주형 DNA 진행방향과 반대 방향으로 주형 서열에 상보적인 nucleotide를 결합시켜 5’->3’방향으로 DNA 합성을 하게 된다. Lagging strand의 이러한 합성 방식은 불연속적인 약 ~200 bp의 DNA 단편 (Okazaki 절편)을 만들게 되는데, DNA ligase를 사용하여 연속적인 가닥으로 연결하게 된다.

PCR은 5종의 효소반응으로 이루어진 복잡한 DNA 복제 과정을 고온에서도 안정한 Taq polymerase와 3종의 효소(Topoisomerase, Helicase, DNA ligase) 반응을 대신할 3단계 온도조절 [Denaturation(열변성)-Annealing(Primer 결합)-Polymerization(DNA 합성)]이 가능한 PCR 기계, DNA primase를 대신할 DNA primer를 사용하여 연속적인 DNA 복제 반응을 가능하게 한 획기적인 유전자 증폭 기술이다. 그럼 PCR 반응을 구성하는 기본 요소에 대해 좀 더 자세히 살펴보자.

 

PCR 반응의 구성 요소

PCR 반응의 구성 요소는, 복제할 유전자의 원본에 해당하는 주형 (template) DNA, PCR primer, Taq polymerase, PCR buffer와 Salts, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), PCR 반응 효율을 높이기 위해 필요에 따라 추가하는 첨가물 (supplements)로 이루어져 있다.

주형 DNA는 genomic DNA, plasmid DNA, PCR 산물 등 DNA는 모두 사용 가능하다. 단, RNAs (mRNA, rRNA)는 Taq polymerase의 주형으로 직접 사용할 수 없어 상보적인 DNA (complementary DNA, cDNA)로 만들어 사용해야 한다. RNA로부터 cDNA를 만드는 과정은 DNA에서 RNA를 만드는 전사 (Transcription)의 반대 과정으로, 역전사 (Reverse transcription)라 한다. RNA를 유전물질로 사용하는 바이러스로부터 유래한 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 합성할 수 있다.

단백질 발현을 목적으로 진핵 세포의 유전자를 주형으로 사용하는 경우 한가지 기억해야 할 것은, 하나의 단백질을 코딩하는 유전자가 연속적인 형태로 존재하는 원핵 세포와 달리, 진핵 세포는 하나의 단백질을 코딩하는 유전자가 여러 개의 단편 (Exon, E)으로 나뉘어져 코딩하지 않는 단편 (Intron, I)과 모자이크 형태 (예, -E1-I-E2-I-E3-)로 "불연속적"으로 이루어져 있다는 점이다. 이런 경우 Intron이 제거되어 연속적인 Exon 형태로 이루어진 mRNA를 사용하여 cDNA를 합성한 후 주형으로 사용하여야 한다.

주형 DNA의 양은 종류에 따라 1 pg~1 µg까지 사용한다. Plasmid와 같이 단일 유전자인 경우 수 pg~수 ng 정도로도 충분하지만, genomic DNA나 cDNA library와 같이 다양한 유전자의 혼합물인 경우 1 µg까지 사용한다.

PCR primer는 증폭하고자 하는 유전자에 특이적이며 상보적인 서열로 구성된 단일 가닥 (single strand)의 DNA 단편이다. PCR primer는 증폭하고자 하는 "유전자의 합성 범위를 지정"하고, PCR 산물의 "특이성을 결정"하는 가장 중요한 요소이다. 또한 Taq polymerase가 DNA 중합 반응을 시작할 수 있도록 "3’OH를 제공"한다.

PCR primer는 크기는 약 20 nucleotides 내외, GC 비율은 50% 내외, Tm (melting temperature)은 55°C 정도를 기본값 (default 값)으로 하여 디자인한다.

Primer는 leading strand (3’<-5’, anti-sense strand)의 시작 (Start) 서열에서부터 정방향으로 상보적인 “Forward primer”와, lagging strand (5’->3’, sense strand)의 마지막 (Stop) 서열에서부터 역방향으로 상보적인 “Reverse primer”, 2개의 쌍 (pair)으로 구성된다.

단백질 발현 목적으로 유전자 전체를 증폭해야 하는 PCR primer는 선택의 폭이 넓지 않아 이러한 조건을 모두 충족하기는 어렵다. 이 경우 PCR 반응 효율이 감소할 수 있는데, PCR 반응액의 조성이나 반응 조건을 적절히 조절하여 문제를 해결하여야 한다.

유전자의 존재 유무만 확인하는 경우, 특이성이 높은 primer 선택이 가능한 일부 서열 (100~500 bp 정도)만 증폭하도록 디자인 한다. Primer 선택의 폭이 넓을 경우, 비특이적인 증폭을 피하기 위해 3’쪽에는 AT보다는 "GC"가 되도록 하고, GC가 연속적으로 4개 이상 되는 서열은 피하도록 한다. PCR 산물의 크기가 100 bp 이하이면 확인 시 primer dimer 혹은 비특이적인 증폭 산물과 구분이 쉽지 않고, 크기가 커지면 PCR 반응 시간이 증가한다.

Primer 디자인은 선호하는 방법에 따라 무료 웹사이트 (예, Primer3: https://bioinfo.ut.ee/primer3/, *PrimerQuest: https://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index, *회원 가입 필요)나 유료 프로그램을 이용하여 기본값을 사용하거나 원하는 조건으로 기본값을 변경하여 디자인한다.

Primer의 특이성은 primer 서열을 입력하면 유사한 서열을 찾아주는 무료 웹사이트인 NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)에서 분석할 수 있다.

예를 들어, 사람의 A 유전자를 증폭하기 위해 디자인한 primer가 A 유전자 이외 다른 유전자와 homology가 높은 것이 많이 존재할수록 A 유전자 이외의 비특이적인 유전자가 같이 증폭될 가능성이 높으므로 피한다.

클로닝을 목적으로 하는 경우, 클로닝 벡터의 "제한 효소 (restriction enzyme)" 자리를 고려하여 각 primer의 5’쪽에 제한 효소 인식 서열 (6~8 bases)을 추가할 수 있다. 이때 제한 효소의 종류에 따라 효율적인 인식 및 절단을 위해 인식 서열 외에 1~5개의 추가적인 nucleotides 를 필요로 하므로 이를 확인 (예, NEB website: https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments)하여 포함시킨다.

이때 주의할 점은 추가하고자 하는 제한 효소 서열이 증폭하고자 하는 유전자 서열 내부에는 존재하지 않아야 한다. 제한 효소 서열의 존재 유무는 무료 웹사이트 (예, Restriction mapper: http://www.restrictionmapper.org)에서 확인 가능하다.

Forward primer의 앞쪽이나 Reverse primer 뒤쪽에 정제나 확인 목적으로 "Tag" (예, -[His]6, myc tag)을 포함시킬 수 있다. Tag은 제한 효소 서열과 유전자 서열 사이에 추가하면 된다. 이 때 tag과 증폭 유전자 사이에 "frameshift" (3개의 nucleotides로 이루어진 아미노산 코딩 frame이 nucleotide의 insertion이나 deletion으로 인해 그 이후의 frame이 어긋나 다른 아미노산이 만들어 지는 것)가 일어나지 않도록 주의해야 한다.

또 한가지 주의할 점은 reverse primer 뒤쪽에 tag을 포함시킬 경우 증폭 유전자와 tag 사이의 “Stop codon”은 반드시 제거하고, tag 뒤쪽에 Stop codon이 포함되도록 해야 한다.

Taq polymerase는 온천이나 열수공 (熱水空; 뜨거운 물이 분출되는 구멍) 근처에서 서식하는 호열성 미생물 (thermophilic eubacteria)인 Thermus aquaticus로부터 분리되어 고온의 열변성 조건에서도 활성을 유지하는 “고온성 DNA 중합효소”이다. 일반적인 DNA polymerase는 최적 온도가 섭씨 37°C 부근이고, 60°C 이상이 되면 단백질 변성이 일어나 활성을 잃어 버린다. 반면, Taq polymerase는 고온의 서식 환경에 적응한 덕택으로 최적 온도가 섭씨 75~80°C이고, DNA 변성 조건인 95°C에서 반감기가 40분일 정도로 고온에서도 안정하게 활성을 유지할 수 있다.

Taq polymerase의 고온 안정성은 DNA 복제에 필요한 다양한 효소들을 대체하고 DNA 중합효소 하나만으로 DNA 변성 (denaturation)-Primer 결합 (annealing)-DNA 중합 (polymerization) 으로 이루어진 PCR cycle을 가능하게 만들었다.

Taq polymerase는 5’->3’ DNA polymerase, 5’->3’ Exonuclease 활성은 있지만, DNA 합성 과정에 잘못 결합된 nucleotide를 제거하여 교정 (proofreading)하는 3’->5’ Exonuclease 활성이 없어, 약 9,000개 중 1개의 빈도도 오류가 발생한다. 이러한 에러율은 PCR 산물에 돌연변이가 도입될 가능성을 높이는데, 3’->5’ exonuclease 활성이 있는 효소를 사용하면 줄일 수 있다.

“Pfu DNA polymerase”는 고온성 고세균인 Pyrococcus furiosus에서 분리된 고온성 DNA polymerase로, 5’->3’ DNA polymerase, 5’->3’ Exonuclease 활성 외에 교정에 필요한 “3’->5’ Exonuclease 활성”도 있어, 약 1,000,000개 중 1개의 빈도로 오류가 발생한다. Taq polymerase에 비해 합성 속도는 상대적으로 낮아 1 kb 증폭에 1~2분이 소요되지만, 돌연변이 도입 가능성을 낮출 수 있다.

Taq polymerase의 독특한 특징 중의 하나는 주형 없이 3’ 말단에 1개의 추가적인 nucleotide를 결합시킬 수 있다. A, T, G, C 중 "A"에 대한 선호도가 가장 높아 일반적인 PCR 산물의 3’ 말단에는 "A overhang"이 만들어진다. 반면, Pfu DNA polymerase는 3’->5’ Exonuclease 활성에 의해 3’ 말단에 A overhang이 만들어지지 않는다. 이러한 이유로 일반 Taq polymerase PCR 산물은 T vector (-T overhang)로 TA cloning이 가능하지만, Pfu DNA polymerase PCR 산물은 TA cloning에 사용할 수 없다.

PCR buffer는 pH를 조정하는 buffer (10~50 mM Tris-HCl, pH7.5~9.0)와 Salts (MgCl2 또는 MgSO4, KCl, (NH4)2SO4), 4 종류의 dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP-각각 0.2 mM씩)와 첨가물 (Supplements, PCR enhancer)을 포함한다.

Mg2+은 Taq polymerase 활성에 필수적인 cofactor로, dNTPs의 alpha phosphate에 결합하여 beta-/gamma-phosphate 제거를 도움으로써 3’-OH와 5’ phosphate간의 phosphodiester 결합을 통한 DNA 합성을 촉진한다. Mg2+ 은 1.5~5 mM (주로 1.5~3.5 mM) 농도 범위에서 사용하며, 농도 조절을 통해 PCR 산물의 증폭 효율을 증가시킬 수 있지만, 고농도에서는 antagonist로 작용할 수 있어 적정 농도 내에서 사용하여야 한다.

Mg2+을 chelating하는 EDTA는 Taq polymerase의 저해제로 작용할 수 있으므로, 주형 DNA와 primer 제조 시 사용을 피하거나, PCR 반응액에서 희석에 의해 저해 농도 이하가 되도록 낮은 농도로만 사용하여야 한다.

KCl은 primer가 template에 결합할 때 반발력을 감소시키고 pairing 효율을 증가시켜 결합을 안정화시키지만, DNA 변성 효율은 감소시킬 수 있다. K+은 35~100 mM (주로 50 mM) 농도 범위에서 사용하며, 농도를 증가시키면 1 kb 이하는 증폭 효율이 증가되지만, 10 kb 이상은 증폭 효율이 감소된다.

(NH4)2SO4는 primer와 template 간에 mismatch로 형성된 수소결합을 약화시켜 특이성을 증가시킨다. (NH4)2SO4는 6~50 mM (주로 16~20 mM) 농도 범위에서 사용한다. 5 kb 이상을 증폭할 경우 KCl을 사용하지 않고 (NH4)2SO4를 16 mM, MgCl2를 3.5 mM로 사용하면 증폭 효율과 특이성을 높일 수 있다. 최근 대부분의 PCR buffer에는 (NH4)2SO4를 포함시키고, KCl 농도는 좀 더 낮게 사용하고 있다.

PCR enhancers는 GC%가 높은 template DNA의 증폭 효율을 높이기 위해 사용하는 첨가물로, Betaine, DMSO, Formamide, Tetramethyl ammonium chloride (TMAC)와 같은 것이 있다.

Betaine (0.5~2.5 M), DMSO (1~10%), Formamide (1.25~10%)는 GC%가 높은 template DNA의 2차 구조 형성과 Tm 값을 감소시켜 증폭 효율을 높인다. Betaine과 DMSO를 같이 사용하면 증폭 효율 개선에 도움이 된다. 다만 DMSO의 농도가 10% 이상에서는 Taq polymerase 활성을 50%까지 감소시킬 수 있어 주의해야 한다.

TMAC (15~100 mM)은 non-specific priming을 최소화하고 Tm 값을 증가시켜 특이성을 증가시킨다.

7-deaza-2’-dGTP는 dGTP 대신 75~100% 정도로 사용하면 GC rich region의 증폭 효율을 높일 수 있다.

BSA (bovine serum albumin)는 Taq polymerase를 안정화시키며, 10~100 µg/mL 농도 범위에서 사용한다. DMSO와 같이 사용할 경우 GC%가 높은 경우나 다양한 크기의 PCR 산물을 증폭할 때 효율을 증가시킨다.

그 외, Non-ionic detergents인 Triton X-100 (0.1~1%), Tween-20 (0.5%), NP-40 (0.5%)는 2차 구조 형성을 억제하고 Taq polymerase를 안정화시켜 증폭 효율을 증가시킬 수 있는 반면, 비특이적인 증폭은 증가시킬 수 있다. Template DNA 시료에 Taq polymerase 활성을 감소시키는 SDS가 포함된 경우 Tween-20과 NP-40를 첨가하면 효과적이다.

 

표준 PCR 반응 조성

표준 PCR 조건은 template DNA와 primer가 일반적인 조건을 충족하는 경우 사용할 수 있다. PCR 반응 조건, 특히 template DNA나 primer의 GC%가 높을 경우, salt나 PCR enhancer 농도를 조절하여 PCR 증폭 효율이나 특이성을 개선할 수 있다.
 




 

표준 PCR 조건

표준 PCR 조건은 PCR 조건 (template DNA, primer, PCR 산물 크기)이 일반적인 범위에 속할 경우 적용할 수다. PCR 조건에 따라 반응 온도와 반응 시간을 증감시켜 PCR 증폭 효율과 특이성을 증가시킬 수 있다. 
 



Initial denaturation은 template DNA의 이중나선 가닥을 single strand로 완전히 분리하는 과정으로, PCR을 시작하는 과정의 처음 1회만 진행한다. 일반적으로는 30초 정도면 충분하지만 GC%가 높거나, colony PCR, hot start PCR의 경우 2~10분까지 증가시킨다. 첫번째 cycle 이후부터는 일반적인 Denaturation 단계로 바로 진행하면 된다.

“Hot Start PCR”은 정상적인 PCR cycle을 시작하기 전에 비특이적으로 결합한 primer나 primer dimer에 의한 비특이적인 증폭을 방지하기 위한 방법이다. Taq polymerase에 항체를 결합시켜 항체가 결합된 상태에서는 활성이 없어 상온 혹은 낮은 온도에서는 DNA 증폭이 일어나지 않는다. Initial denaturation 단계의 고온에서 비특이적인 primer 결합이 분리되고 항체가 변성되면 Taq polymerase가 활성화되어 DNA 증폭이 일어나도록 하는 방법으로, PCR 반응의 특이성을 증가시킬 수 있다.

Annealing은 single strand로 분리된 template DNA에 상보적인 PCR primer가 결합하는 과정으로, 온도를 높이면 특이성은 증가하나 증폭 효율은 감소할 수 있다. Annealing 온도는 primer의 Tm 값에 따라 45~68°C 범위에서 조절한다. Annealing 온도는 "Tm [2x(A+T)+4(G+C)]-5°C"를 기본으로 증폭 효율을 높이기 위해서는 보다 낮게, 특이성을 높이기 위해서는 보다 높게 설정한다.

PCR primer에 제한 효소 서열을 추가한 경우 초기 수 cycle 이후에 제한 효소 서열을 포함한 Tm값으 고려하여 annealing 온도를 높여 주면 특이성을 높일 수 있다. Annealing 온도가 65°C 이상인 경우 annealing과 extension 온도를 동일하게 하고 반응시간을 증가시켜 2-steps으로 PCR을 진행할 수 있다.

Extension은 DNA 중합 반응이 일어나는 과정으로, 반응 온도는 Taq polymerase의 경우 72°C, Pfu DNA polymerase의 경우 68°C를 주로 사용한다. Extension 시간은 1 min/kb를 기준으로 하되, Pfu DNA polymerase는 합성 속도가 느리므로 이보다 시간을 증가시킬 수 있다. PCR 반응을 30 cycles 이상으로 하는 경우, 효소 활성이 시간에 따라 감소하므로, 30 cycles 이후 매 cycle 마다 시간을 증가 (1°C/cycle) 시키면 증폭 효율을 다소 높일 수 있다.

Final Extension은 Taq polymerase가 DNA 합성을 시작하는 시간이 모두 동일하지 않은 것을 고려하여, 마지막 단계에 PCR 산물의 크기와 무관하게 충분한 DNA 합성 시간 (5 min)을 추가함으로써 DNA 합성이 끝까지 이루어질 수 있도록 하는 단계이다. 

 

PCR 산물 확인 방법

PCR 결과를 확인 방법은 PCR의 최종 산물을 Agarose gel 상에서 전기영동 한 후 EtBr (Ethidium bromide)이나 SYBR dye 등을 사용하여 DNA를 염색하여 확인하는 “일반 PCR”과, 형광 dye를 사용하여 PCR이 진행되는 동안 실시간으로 증폭 정도를 확인하는 “Real-Time PCR”로 구분된다.

Agarose gel에서 확인하는 경우 0.7~1,5%의 agarose gel 상에서 PCR 최종 산물을 전기영동 하고, DNA 가닥에 결합하는 EtBr이나 대체품인 SYBR dye를 사용하여 DNA를 염색한 후 UV 상에서 DNA band를 확인하는 방법이다.

Real-Time PCR은 1쌍의 PCR primer와 형광 dye (예, SYBR Green)를 사용하여 증폭된 PCR 산물의 이중 나선에 형광 dye가 결합하면 증가된 형광을 검출하는 방식과, 1쌍의 PCR primer와 “형광 (F)과 Quencher (Q)가 결합된 probe”를 함께 사용하는 “TaqMan 방식”이 있다.

TaqMan 방식은 1쌍의 PCR primer와 함께 증폭하고자 하는 서열 내부에 결합하는 “Probe”를 추가로 사용한다. Probe의 양 말단에는 형광 dye (F)와 형광을 방해하는 Quencher (Q)가 결합되어 있다. Quencher가 결합된 형태의 probe는 형광을 띄지 않는다. Taq polymerase가 Primer에서 상보적인 DNA 합성을 시작하여 내부 서열에 결합된 probe의 5’에 도달하면, Taq polymerase의 5’->3’ exonuclease 활성에 의해 probe가 분해된다. 분해 과정에 형광 dye가 Quencher로부터 분리되면 형광을 나타낸다. TaqMan 방식은 1쌍의 primer 외에 추가적인 probe를 사용하기 때문에 PCR 특이성은 증가하고 background는 감소한다.
 



Figure 3 SYBR Green qPCR과 TaqMan qPCR 비교

 

[개념 요약]

PCR (polymerase chain reaction): 고온성 Taq polymerase와 온도 변화 (Denaturation-Annealing-Polymerization)를 프로그램으로 자동으로 조절할 수 있는 PCR 기계를 사용하여 DNA 복제 반응을 연쇄적으로 반복하여 DNA를 증폭하는 기술
PCR 구성 요소: Template DNA (genomic, plasmid, cDNA), PCR primer pair (증폭 산물의 범위 및 특이성 결정), Taq polymerase (Taq, Pfu DNA polymerase), PCR buffer (salts, supplements), dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
PCR 반응 조건: Initial denaturation (초기 변성)/ Denaturation (변성, 이중나선 분리)-Annealing (Primer 결합)-Extension (DNA 합성)/ Repeat PCR cycles (25-45 cycles)/ Final Extension (DNA 합성 마무리)