체계적인 교육과 실무위주의 미래지향적 교육!

의생명공학과

바이오산업동향

차세대 유전자 가위, 프라임에디팅의 정확성 검증
등록일
2020-11-11
작성자
의생명공학과
조회수
34

한국생명공학연구원 김대식, 김용삼 박사 height=
한국생명공학연구원 김대식, 김용삼 박사


국내연구진이 2020년 10대 바이오미래유망기술로 선정된 차세대 유전자가위인 프라임에디팅의 효율성 및 정확성을 검증하였다. 향후 프라임에디팅의 유전자 치료제 및 새로운 유전자교정 도구로 활용에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.

한국생명공학연구원(이하 생명연) 유전자교정연구센터 김대식, 김용삼 박사팀(교신저자: 김대식/김용삼 박사, 제1저자: 김도연/문수빈 연구생)이 수행한 이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 바이오의료기술개발사업 및 국가과학기술연구회가 추진하는 창의형 융합연구사업(CAP), 기초과학연구원지원사업의 지원으로 수행되었고, 생물학 분야의 세계적 저널인 ‘뉴클레익 애시드 리서치’ (Nucleic Acids Research, IF 11.501) 9월 16일자(한국시각 9월17일) 온라인 판에 게재되었다.
(논문명 : Unbiased investigation of specificities of prime editing systems in human cells)

프라임에디팅은 2019년 10월 미국 브로드연구소에서 최초로 발표하였으며 희귀 유전병의 90%까지 치료가 가능한 차세대 유전자 가위 기술이다. 기존의 유전자 가위의 정밀도를 향상 시키면서 단점을 해결한 기술로 자유로운 유전자 교정이 가능하다.

CRISPR(크리스퍼)시스템은 2013년 소개된 이후 유전자교정 분야는 혁명적으로 발전하고 있다. 유전자 교정의 핵심인 유전자 가위기술을 통하여 유전자의 제거, 삽입, 치환을 유도하여 기초연구 및 유전자 치료 등의 다양한 분야에 활용되고 있다.

염기서열의 변화를 위한 여러 유전자 가위 기술들이 개발되었으나 대부분의 유전질환에 적용하기에는 한계를 가지고 있었다. 프라임 에디팅은 이러한 한계를 극복할 수 있는 유전자 가위 기술로 유전질환의 약 90%를 치료할 수 있을 것으로 학계는 기대하고 있다.  연구팀은 프라임에디팅의 정확성을 검증할 수 있는 기술을 개발하여, 프라임에디팅의 효율성과 정확성을 검증하였고 보다 안전한 프라임에디팅 방법에 대하여 보고하였다.

연구팀은 동물세포에서 프라임에디팅의 효율성을 확인하였고 정확성 검증을 위한 기술을 최적화 하였다. 특히 기존에 널리 사용하고 있는 Cas9 유전자 가위와 비교하여 높은 정확성을 가지는 것을 확인하였다.

또한 기존 프라임에디팅에 비해 높은 정확성을 가지는 프라임에디팅 변이체들을 제작하였다.

연구책임자인 김대식, 김용삼 박사는 “동 연구성과는 프라임에디팅의 높은 효율성과 정확성을 검증함으로써 유전자치료제로의 가능성을 시사하는 것”이라며,

 “적용범위가 넓은 프라임에디팅의 효율성과 정확성을 검증함으로서 하나의 유전자 가위 기술로 다양한 유전자교정이 가능하고 전달기술과 같은 보조기술의 발전과 함께 유전자치료에 대한 활용가능성이 높아졌다”고 밝혔다.

 

연   구   결   과   개   요

□ 연구배경
○ 박테리아의 후천적 면역 시스템 중 하나인 CRISPR 시스템의 발견은 유전자 교정 기술에 큰 발전을 야기하였다. CRISPR 시스템을 이용한 유전자 교정 기술은 그 편리성과 효율성을 바탕으로 다양한 분야의 연구에서 사용되어 종래의 사용되던 유전자 교정기술에 비해 세포 및 다양한 동물 모델에서의 유전자 교정에 필요한 시간 및 금액의 단축, 외래 유전물질의 도입 없는 작물의 형질전환 등을 가능케 하였다. 또한 전 세계적으로 전임상 및 임상실험을 통해 새로운 질병 치료제로서의 가능성을 보여주고 있다.
○ 위와 같이 다양한 분야에서의 유전자 교정을 위한 유전자 교정 기술 자체에 대한 중요성과 관심이 대두되면서 Cas9과 같이 하나의 뉴클레이스(nuclease)를 갖는 새로운 유전자 가위 기술에 대한 여러 연구가 보고되었고 Cas9뿐만 아니라 Cas12a, Cas13, Cas14 등 다양한 종류의 유전자 가위가 각각의 장점을 가지고 활용되고 있다.
○ 유전자 교정은 결실, 삽입, 치환 등의 방법을 이용하는데 이를 위하여 기존의 유전자 가위를 이용한 Base editor, Transposase 등의 기술들이 개발되었다. 이러한 기술들을 활용하여 연구개발, 식물, 기술, 의료등 다양한 분야에 CRISPR 시스템을 적용하는 많은 연구들이 이루어지고 있고 최근에는 인간의 배아를 교정한 사례까지 발표되었다.
○ CRISPR 시스템의 활발한 연구와 함께 이 기술들의 효율과 정확성을 확인하고자 하는 연구가 진행되었으며 현재 다양한 방법의 정확성을 검증할 수 있는 방법이 개발되었다.
○ 2019년 10월 발표된 프라임에디팅 기술은 차세대 유전자 가위 기술로써 기존에 사용하고 있는 유전자 가위 기술들의 단점을 극복하고 자유자재로 유전자 교정이 가능하다는 장점이 있다.
 
□ 연구내용
○ 연구팀은 프라임에디팅의 정확성을 검증을 위한 기술을 개발하여 동물세포에서의 높은 효율성과 정확성을 확인하였다.
○ 프라임에디팅은 기존의 3세대 유전자 가위 기술인 CRISPR/Cas9과 역전사 효소(Reverse Transcriptase)를 이용하여 유전자 교정을 한다. 기존의 유전자 가위는 DNA 이중가닥을 모두 절단하고 세포가 자연복구되는 메커니즘으로 작동하지만 프라임에디팅은 DNA 단일가닥을 절단하고 원하는 염기서열을 직접 삽입하는 방식을 사용한다. 
○ 이번 연구에서 연구팀은 nDigenome seq방법을 개발하여 프라임에디팅을 통해 발생할 수 있는 비표적 절단을 확인하였고 프라임에디팅의 높은 정확성을 검증하였다. 또한 프라임에디팅 변이체들의 정확성 및 효율성을 확인하였다. 
○ 프라임에디팅이 이용하는 신장된 가이드 RNA(pegRNA)의 불일치를 이용하여 프라임에디팅에서 발생할 수 있는 비표적 절단의 다양한 가능성에 대하여 검증하였고 DNA 단일가닥 절단의 중요성과 가이드 RNA 신장 길이에 따른 효율성과 정확성을 제시하였다. 
○ 또한 Cas9 변이체들을 이용하여 만든 프라임에디팅 변이체들의 효율성 및 정확성을 측정한 결과, 기존 프라임에디팅과 비교하여 더 높은 정확성을 가지는 것을 확인하였다.
○ 즉, 본 연구의 성과는 차세대 유전자 가위 기술로 떠오른 프라임에디팅이 높은 효율성뿐만 아니라 높은 정확성을 가지고 있다는 것을 검증하여 프라임에디팅의 다양한 활용을 시사하며, 특히 유전질환의 90%까지 치료가 가능할 것이라고 기대되는 프라임에디팅의 유전자치료기술로 활용 가능성을 제시하고 있다.

□ 연구성과의 의미
▶ 프라임에디팅의 효율성 및 정확성 검증 : 프라임에디팅의 유전자 치료제로의 가능성 제시
○ 본 연구의 프라임에디팅의 효율성 및 정확성 검증은 차세대 유전자 가위 기술이라고 알려진 프라임에디팅의 안전성을 확인하는 세계 최초의 연구결과라고 할 수 있다. 이는 특히 유전자치료 분야에서 중요한 이슈인 정확성의 문제에 대하여 검증한 것이며, 기존의 유전자 가위 기술들보다 프라임에디팅이 높은 정확성을 가짐으로써 유전자 치료제로 활용할 가능성이 높을 것으로 예상된다.
○ 또한, 프라임에디팅의 유전자 교정에 적합한 가이드 RNA와 프라임에디팅 변이체들의 효율성과 정확성을 검증함으로써 후속연구 및 다양한 분야에 활용될 것으로 기대된다.

프라임 에디터 개념 및 작동 원리
[그림 1]  프라임 에디터 개념 및 작동 원리
프라임 에디터는  DNA 이중가닥 중 한 가닥만 절단하도록 변형된 Cas9 단백질(Cas9 nickase)과 역전사효소로 구성된다. 새로운 형태의 가이드 RNA인 pegRNA는 표적 유전자의 비표적 가닥에 상보적인 염기서열(PBS ; primer binding site) 및 교정하고자 하는 염기서열을 포함하는 역전사효소의 주형가닥 부위(RT template)를 갖는다. 프라임 에디터의 Cas9 nickase가 표적 유전자의 비표적가닥을 절단하고 역전사효소가 pegRNA의 RT template를 주형으로 하여 교정된 염기서열이 포함된 새로운 DNA 가닥을 합성한다. 이후 세포 내 복구과정에 의해 기존의 DNA 염기서열이 제거되고 새로 합성된 교정된 형태의 DNA 염기서열이 이를 대신한다.

프라임 에디터 정확성을 검증 기술
[그림 2]  프라임 에디터 정확성을 검증 기술
프라임 에디터가 작동을 하기 위해서는 Cas9 nickase에 의해 단일가닥절단 (Single-stranded DNA breaks)가 필수적으로 일어나야 한다. 이에 따라 연구진은 프라임 에디터의 작용에 필수적인 Cas9 nickase의 정확성을 측정하고자 개량된 절단 유전체 시퀀싱((Digenome-seq) 기법을 이용했다. 기존의 절단 유전체 시퀀싱 기법은 DNA 두 가닥 절단이 유도되어야 하는데, 이번 연구에서는 단일 가닥의 절단 위치를 찾을 수 있는 새로운 기법(nickase-mediated Digenome-seq; nDIgenome-seq)을 개발하였다. 연구진은 이 방법을 활용해 절단 유전체 시퀀싱 기법을 진행하여 Cas9 nickase의 정확성을 측정하는데 성공했다.

 
Cas9 변이체를 이용한 프라임 에디터의 정확성 증대
[그림 3]  Cas9 변이체를 이용한 프라임 에디터의 정확성 증대
프라임 에디터의 정확성을 높이기 위해 기존의 Cas9과 비교하여 표적 특이성이 높다고 알려진 다양한 Cas9 변이체를 이용하여 프라임 에디터 변이체를 제작하였다. 기존의 프라임에디터와 제작된 프라임 에디터 변이체의 표적 유전자(On-target) 및 비표적 유전자(Off-target)에 대한 교정 효율을 비교한 결과, 프라임 에디터 변이체를 사용한 경우에 기존 프라임 에디터에 비해 정확성이 증대되는 것을 확인하였다. 특히, ePE2 및 SniperPE2는 표적 유전자에 대한 교정 효율은 기존의 프라임 에디터의 수준을 유지하며 비표적 유전자에 대한 효율은 감소하는 것으로 나타났다.

원문 보기 (클릭)